當回轉(zhuǎn)驗證后呈陽性結(jié)果，需要GST-PULL DOWN（非生理條件下的驗證，僅是體外驗證，）；

如果想進一步確定結(jié)果，可以做CO-IP,（生理條件下的驗證，結(jié)果比較可靠）；

IP與CO-IP的關(guān)系：

IP就是用抗體把你要的蛋白免疫沉淀下來，然后去檢測它。例如蛋白A在細胞內(nèi)的蛋白量不同，或者有著不同的翻譯后修飾，這是可以用A蛋白的抗體+prorein A beads來IP，從細胞中把A拉下,再用特異的抗體（如磷酸化，泛素化抗體）來檢測A的變化。

co-ip的原理和IP是一樣的，但是它檢測的是和A相互作用的蛋白，也就是說用A的抗體把A拉下來后，用和A相互作用蛋白B的抗體去檢測，來證明A和B之間的相互作用。 就是說只要用A的抗體把B拉下來就能證明A和B之間有相互作用。

這種關(guān)系只能說是存在相互作用，但這種相互作用并不能確定是直接的還是間接的，也就是所也許是A與c作用，而B也和C作用，這樣，用A的抗體可以把C拉下來，但同時C又把B也拉下來了。要確定A和B之間直接的相互作用，你可以做體外的GST PULL DOWN實驗。

GST pull-down實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗技術(shù),近年來越來越受到廣大學(xué)者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種“誘餌蛋白",目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白"(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白"和“捕獲蛋白"均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行,操作方便。（GST：谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)）

GST pull down 和 Coim munoprecipitation關(guān)系問題

啥叫GST pull down , Coimmunoprecipitation呢? 學(xué)過生物的地球人都知道. 這是研究蛋白質(zhì)相互作用的兩種方法.

簡單通俗的打個比方, GST pull down 就像把一男一女放在孤島上, 除非蜂馬牛不相及, 同類男女之間該發(fā)生的一般都會發(fā)生. 這種關(guān)系是直接的.

Coimmunoprecipitation, (Co-IP) 則是, 眾里尋他千百du, 那人卻在燈火闌珊處. 研究一群男女間的自由戀愛問題. 一個蛋白在本性上可以同時喜歡很多其他的蛋白, 但是最終還是會有個最喜歡的, 而在Co-ip中就能發(fā)現(xiàn)他的喜好. 這種關(guān)系可能是直接的, 也可能是間接的, 是更接近于東方的.

兩個蛋白可能在生物體內(nèi)素昧平生, 一個在頭上, 一個在腳上. 也許兩者之間或許很合轍, 生來卻天各一方. 在GST pull down 的環(huán)境中, 他們可能相遇, 吸引在一起. 但在現(xiàn)實生活中, 這樣的浪漫關(guān)系可能是不現(xiàn)實的. 腳上的蛋白若是跑到頭上與情人幽會, 人就要出大問題. 還有的情況是, 兩個蛋白即使獨處在一起, 也可能不會互相吸引, 但是到了生物系統(tǒng)的大環(huán)境中, 在其他蛋白, 各種因素適當?shù)妮o助下, 卻有可能形成穩(wěn)定的搭檔關(guān)系。

免疫共沉淀實驗由于在非變性實驗條件性進行，這樣蛋白質(zhì)之間的天然相互作用得以zui大程度的保留，因此可以比較真實的反應(yīng)蛋白質(zhì)之間的相互作用。但也基于此點，免疫共沉淀并不能顯示蛋白質(zhì)之間的相互作用是直接還是間接的，因為通過目的蛋白抗體共沉淀下來的是一個蛋白復(fù)合物，而不僅僅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。而GST-Pull down實驗可以通過體外實驗條件，去除其它蛋白的影響，從而確定目的蛋白和待檢測蛋白是否可以發(fā)生直接相互作用。

做蛋白質(zhì)相互作用的三個經(jīng)典方法，也可以說是逐步嚴謹?shù)姆椒ā?/p>

凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)

凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA, electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測 如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNApian段和寡核苷酸片段（特異）， 和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。

GST親和層析和GST Pull-down方法

此方法的基本原理是：利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結(jié)合。因此，當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復(fù)合物混合時就可被吸附而分離。在病毒受體研究中，融合蛋白通常設(shè)計為病毒吸附蛋白（VAP）。這方面成功的例子有HBV。具體做法如下：將GST-融合探針蛋白 （VAP）和GTH-Sepharose制成親和層析柱，然后待分析的蛋白質(zhì)混合液流經(jīng)親和層析柱，梯度洗脫， 分離、收集各蛋白組分，這稱為GST親和柱層析（GST affinity column chromatography）。

如果一開始待檢蛋白就和GST- 融合探針蛋白與 GTH-Sepharose一起共同孵育，經(jīng)離心收集洗脫復(fù)合物和洗滌后，再加入過量GTH獲得相互作用蛋白的復(fù)合物，那么這種方法則稱為GST pull down。

GST親和層析及相應(yīng)的GST Pull-down方法的優(yōu)點是敏感，對混合物中的所有蛋白均“一視同仁"，也可用于受體功能的鑒定。缺點是GST有可能影響融合蛋白的空間結(jié)構(gòu)，另外，蛋白質(zhì)濃度對實驗也有一定影響。